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產(chǎn)品說(shuō)明：

使用說(shuō)明：

1. G418儲(chǔ)存液的配制（50 mg/mL，活性濃度）

1）活力單位的換算

根據(jù)此公式進(jìn)行換算：（1000/A0）×A1=A2，其中A0是G418的活力值（Potency），因批次而異。可見(jiàn)批次對(duì)應(yīng)的質(zhì)檢報(bào)告，或者瓶子上的標(biāo)簽。A1是想配制的活性G418濃度。A2是實(shí)際稱(chēng)重的粉末與體積比濃度。

比如若所用批次的G418 活力值為：750 μg/mg，要配制50 mg/mL的G418活性濃度，則實(shí)際要配制的粉末濃度為1000/750×50 mg/mL=66.33 mg/mL。

如果配制10 mL的G418儲(chǔ)存液（活性濃度，50 mg/mL），則需要稱(chēng)取663.3 mg粉末。

2）除菌和保存

根據(jù)上述換算得到的實(shí)際粉末稱(chēng)重量，加入10 mL無(wú)菌去離子水內(nèi)使其完全溶解。

先用5 mL無(wú)菌去離子水預(yù)濕潤(rùn)0.22 μm針頭式過(guò)濾器，除盡水。之后使用此濾器過(guò)濾，除菌后分裝成單次使用的小量（如1mL）放到-20℃凍存，1年穩(wěn)定。

【注】：①不要對(duì)混濁的溶液進(jìn)行過(guò)濾，因?yàn)榛鞚岬娜芤阂馕吨赐耆芙猓^(guò)濾過(guò)程中會(huì)造成藥物損失，降低終液的活性。

              ②不建議使用液體培養(yǎng)基，NaCl，磷酸鹽溶液或者有機(jī)溶劑來(lái)制備儲(chǔ)存液。

2. 常用篩選濃度

一般來(lái)說(shuō)，剛開(kāi)始篩選轉(zhuǎn)化子需要高濃度的G418，并用一個(gè)較低濃度的G418用于維持培養(yǎng)。生長(zhǎng)條件，細(xì)胞類(lèi)型和其他的環(huán)境因素都可能影響G418的用量，因此第一次使用的實(shí)驗(yàn)體系建議通過(guò)殺滅曲線（kill curve），即劑量反應(yīng)性曲線，來(lái)確定最佳篩選濃度。

通常情況，哺乳動(dòng)物細(xì)胞篩選范圍200-2000 μg/mL；植物細(xì)胞：10-100 μg/mL；酵母細(xì)胞：500-1000 μg/mL。

以下是一些細(xì)胞類(lèi)型使用G418篩選使用的濃度，可做參考：

3. 殺滅曲線的建立

【注意事項(xiàng)】：

為了篩選得到穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞株，需要確定能夠殺死未轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的抗生素最低濃度，可通過(guò)建立殺滅曲線來(lái)實(shí)現(xiàn)，至少選擇6個(gè)濃度。處理分裂期的細(xì)胞時(shí)G418的活性最強(qiáng)，因此在添加G418之前需要讓細(xì)胞培養(yǎng)一段時(shí)間。

1) 第一天：未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞按照20-25%的細(xì)胞密度鋪在合適的培養(yǎng)板上，37℃，CO2培養(yǎng)過(guò)夜。

【注】：對(duì)于需要更高密度來(lái)檢測(cè)活力的細(xì)胞，可增加接種量。

2) 根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型，設(shè)定合適范圍內(nèi)的濃度梯度。以哺乳動(dòng)物細(xì)胞為例，可設(shè)定0，50，100，200，400，800，1000 μg/mL。

3) 第二天：去除舊的培養(yǎng)基，換用新鮮配制的含有相應(yīng)濃度藥物的培養(yǎng)基。每個(gè)濃度做三個(gè)平行孔。

4) 接下來(lái)每3-4天更換新的含藥物培養(yǎng)基。
5) 按照固定的周期（如每2天）進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)來(lái)確定阻止未轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長(zhǎng)的恰當(dāng)濃度。選擇在理想的天數(shù)（通常是7-10天）內(nèi)能夠殺死絕大多數(shù)細(xì)胞的最低濃度為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選用的工作濃度。

4. 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選

1) 轉(zhuǎn)染48 h后，用含有適當(dāng)濃度的G418篩選培養(yǎng)基來(lái)傳代細(xì)胞（直接傳代或者稀釋后傳代）。
【注】：細(xì)胞處于活躍分裂狀態(tài)時(shí)抗生素的殺傷效果最好。當(dāng)細(xì)胞過(guò)于稠密，其效率會(huì)降低。為了得到較好的篩選效果，最好將細(xì)胞稀釋至豐度不超過(guò)25%。

2) 每隔3-4天更換含有藥物的篩選培養(yǎng)液。
3) 篩選7天后觀察并評(píng)估細(xì)胞克隆（集落）的形成情況。集落的形成可能還需要一周或者更多的時(shí)間，這取決于宿主細(xì)胞類(lèi)型，轉(zhuǎn)染以及篩選效果。

4) 挑取并轉(zhuǎn)移5-10個(gè)抗性克隆于35 mm細(xì)胞培養(yǎng)板，繼續(xù)用含藥物的篩選培養(yǎng)液維持培養(yǎng)7天。

5) 之后更換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)即可。

注意事項(xiàng)：

1) 本品不可高壓滅菌；
2) G418不要和其他的抗生素/抗真菌劑（如青霉素/鏈霉素）共同使用，因?yàn)樗鼈兪荊418的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。其他的抗生素也會(huì)產(chǎn)生交叉活性。

3) 配制G418溶液時(shí)，一定要根據(jù)G418批次不同的活力值（potency）來(lái)進(jìn)行換算，從而得到需要活性濃度的儲(chǔ)存液及工作液。
4) G418加入培養(yǎng)體系中未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞有可能不會(huì)被殺死，原因在于藥物濃度過(guò)低，或者細(xì)胞密度過(guò)高。另外，快速分裂的細(xì)胞相對(duì)于緩慢增殖細(xì)胞，更容易被殺死。對(duì)照細(xì)胞（未轉(zhuǎn)染）可能抗生素添加5-7天后才能殺死，轉(zhuǎn)染細(xì)胞（抗性克隆子）的克隆需要10-14天形成。

5) 即使加入殺死劑量的G418，細(xì)胞可能會(huì)繼續(xù)分裂2-3次。G418的藥效通常在2天后才變得明顯。

6) 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

本產(chǎn)品僅供科研使用，不可用于臨床診斷應(yīng)用或其他用途。